Джованни Альфонсо Борелли родился 28 января 1608 года в Кастель Нуово (предместье Неаполя), в семье испанского солдата. Учился в Риме, изучал медицину и математику у Кастелли (вместе с Торричелли).
С 1635 года Борелли работал в университете Мессины.
В 1649 году получил должность профессора математики.Примерно в начале 1640-х годов познакомился с Галилеем. Борелли продолжил систематическое изучение открытых Галилеем спутников Юпитера.
В своей книге «Теория Медичийских планет» он сделал исключительно важный на тот момент вывод, что для них, как и для планет, выполняются законы Кеплера.
В этой же книге он сформулировал несовершенный, но принципиально верный вариант закона всемирного тяготения.
В 1656 году Борелли занял кафедру математики в Пизанском университете. Здесь он познакомился с врачом Марчелло Мальпиги, который одним из первых начал исследования с помощью микроскопа. Борелли также увлекся этой тематикой и получил ряд ценных результатов.
Он изучал под микроскопом состав крови животных и работу устьиц растений.Борелли впервые рассмотрел возможность создания дыхательного аппарата для подводных исследований. Борелли считается основоположником биомеханики.Джованни Альфонсо Борелли скончался 31 декабря 1679 года в Риме. Его главный труд по биомеханике — «О движении животных» , был издан посмертно в 1680 году.