Родился Чарлз Бест 27 февраля 1899 года в Уэст-Пембруке. Вскоре после рождения покинул США и переехал в Канаду, в город Торонто и посвятил этому городу всю оставшуюся жизнь.
В 1916 году в возрасте 17 лет поступил в университет в Торонто, который окончил в 1921 году, но одного диплома было мало, тогда он в 1921 году защитил степень бакалавра, в 1922 году — магистра, а в 1925 году — доктора медицины. Будучи студентом Торонтского университета, с 1920 по 1921 год работал на кафедре физиологии, в 1929 году стал заведующим этой кафедры и профессором Торонтского университета и проработал вплоть до 1941 года.
В 1923 году совместно с Ф. Г. Бантингом при Торонтском университете создаёт институт, названный именами двух биологов, в котором с 1923 по 1941 год занимал должность доцента кафедры медицинских исследований, а с 1941 по 1978 год — должность директора отдела медицинских исследований. Во время Второй Мировой войны возглавлял хирургическую службу Королевского Канадского добровольческого морского резерва и Отдел медицинских исследований Королевского Канадского флота.Скончался Чарлз Бест 31 марта 1978 года в Торонто.