Гвидо Альтарелли родился 12 июля 1941 года в Риме.
В 1963 году он окончил физический факультет Римского университета Ла Сапиенца.После этого Альтарелли занимался научными исследованиями по физике во Флорентийском университете, где в 1965 году он защитил диссертацию. Его научным руководителем был Рауль Гатто[it]. Альтарелли продолжал работать во Флорентийском университете до 1968 года.Затем Альтарелли несколько лет работал в США: в 1968—1969 годах — в Нью-Йоркском университете, а в 1969—1970 годах — в Рокфеллеровском университете.
В 1970 году Гвидо Альтарелли возвратился в Италию, где он получил должность в Римском университете Ла Сапиенца, а в 1980 году он стал профессором теоретической физики того же университета, проработав там до 1992 года.
В 1992 году он перешёл на должность профессора в создаваемый в то время новый Третий Римский университет[it] (итал. Roma Tre).
С 1987 по 2006 год Гвидо Альтарелли также работал научным сотрудником теоретического отдела ЦЕРНа, а в 2000—2004 годах возглавлял этот отдел.
Он также был членом консультативных комитетов ЦЕРНа, DESY и ряда других организаций и институтов, а также иностранным членом Польской академии наук.