Ван Россум родился и вырос в Нидерландах, где он закончил Амстердамский университет по специальности «математика и информатика» в 1982 году. Затем он работал в различных исследовательских институтах, в том числе Голландском центре математики и информатики (Амстердам), Национальном Институте Стандартов (США) и Corporation for National Research Initiatives (США).
В 2001 году ван Россум получил премию Free Software Award, а в 2002 году — премию Нидерландской ассоциации профессионалов UNIX (NLUUG).
В 2006 он был признан Ассоциацией вычислительной техники «выдающимся инженером» .
В декабре 2005 года ван Россум был принят на работу в Google, где он разработал на Python веб-приложение для рецензирования кода (code-review) Mondrian. Также принимал активное участие в разработке компанией Google сервиса хостинга сайтов и web-приложений Google App Engine.7 декабря 2012 года был последним днём работы в Google. C 1 января 2013 приступил к работе в Dropbox.12 июля 2018 года ван Россум объявил о своём намерении покинуть пост «великодушного пожизненного диктатора» (BDFL) проекта по разработке языка программирования Python .Личная жизньГвидо ван Россум — брат Юста ван Россума (нидерл. Just van Rossum), шрифтового дизайнера и программиста. Юст создал шрифт, который используется в логотипе «Python Powered» .
В настоящее время Гвидо живёт в Калифорнии с женой-американкой Ким Нэп (Kim Knapp) и их сыном Орлейном (Orlijn).